机械应力相关基因在骨关节炎软骨下骨的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.22.014

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (22): 4084-4090.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.22.014

• 骨与关节生物力学 bone and joint biomechanics • 上一篇下一篇

机械应力相关基因在骨关节炎软骨下骨的表达

方航¹，张荣凯²，陈郁鲜¹，宋炎成³，蔡道章^1，3

1中山大学附属第三医院骨科，广东省广州市 510630
2中山大学附属第五医院骨科一区，广东省珠海市 519000
3南方医科大学第三附属医院关节外科，广东省广州市 510630

出版日期:2013-05-28 发布日期:2013-05-28
通讯作者: 蔡道章，博士，教授，中山大学附属第三医院骨科，广东省广州市 510630；南方医科大学第三附属医院关节外科，广东省广州市 510630 caidaozhang@gmail.com
作者简介:方航☆，男，1986年生，广东省普宁市人，汉族，中山大学在读博士，主要从事关节炎的早期诊断与早期干预研究。 fanghang@outlook.com
基金资助:
国家863高技术研究发展计划资助项目(2008AA02Z437)。

Expression of mechanical stress related genes in subchondral bone of rat osteoarthritis model

Fang Hang¹, Zhang Rong-kai² , Chen Yu-xian¹ , Song Yan-cheng³, Cai Dao-zhang^{1, 3}

1 Department of Orthopedics, the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China
2 First District, Department of Orthopedics, the Fifth Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Zhuhai 519000, Guangdong Province, China
3 Department of Joint Surgery, the Third Affiliated Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China

Online:2013-05-28 Published:2013-05-28
Contact: Cai Dao-zhang, M.D., Professor, Department of Orthopedics, the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China; Department of Joint Surgery, the Third Affiliated Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China caidaozhang@gmail.com
About author:Fang Hang☆, Studying for doctorate, Department of Orthopedics, the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China fanghang@outlook.com
Supported by:
National High-tech Research and Development Program of China (863 Program), No.2008AA02Z437*

摘要/Abstract

摘要：

背景：机械应力改变是骨关节炎发生发展的关键因素。
目的：观察机械应力相关基因在关节不稳所致的骨关节炎大鼠模型中软骨下骨的表达情况，为阐述机械应力因素在骨关节炎发病中的重要作用提供依据。
方法：将SD大鼠分为实验组和对照组，每组30只。实验组行右膝内侧半月板及内侧副韧带切除术，对照组仅切开关节囊。分别于术后1，2，4周取右膝关节标本，提取软骨下骨的RNA，并采用全基因表达谱芯片技术研究软骨下骨全基因表达，根据现有文献报道，探索机械应力相关基因在该大鼠模型软骨下骨中的表达情况，并通过qRT-PCR对结果进行验证。
结果与结论：发现3个重要的与机械应力相关的差异表达基因：Postn，Ihh，Bmp5，并由qRT-PCR得到验证：实验组中，Postn在术后第1周显著高表达，与对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，术后第2周也出现高表达的趋势，但与对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)。Bmp5也在术后第1周显著高表达，与对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，第2周及第4周也有高表达的趋势，但与对照组比较差异无显著性意义(P >0.05)。Ihh在术后第1周及第2周同时出现高表达，与对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。结果可见机械应力因素是骨关节炎发病的重要因素，深入研究与其相关的基因或其通路，可能为揭示骨关节炎发病机制提供更多的依据，从而发现早期诊断及早期治疗的靶点。

关键词: 骨关节植入物, 骨与关节生物力学, 骨关节炎, 软骨下骨, 机械应力, Postn, Bmp5, Ihh, 大鼠骨关节炎模型, 关节不稳, 基因芯片, 全基因组, 863项目

Abstract:

BACKGROUND: Changes of mechanical stress is a key factor for the development of osteoarthritis.
OBJECTIVE: To observe the expression of mechanical stress related genes in subchondral bone of rat osteoarthritis model caused by joint instability, and to provide basis for elaborating the effect of mechanical stress factors in the pathogenesis of osteoarthritis.

METHODS: Sprague Dawley rats were divided into two groups: experimental group and control group, 30 rats in each group. The right knee joints of experimental group underwent both medial collateral ligament resection and medial meniscectomy, while the control group just cut joint capsule. Rats were sacrificed at 1, 2 and 4 weeks after surgery to obtain the right knee joints. Total RNA of the subchondral bone was extracted, and the global gene expression of subchondral bone was researched with DNA microarray technology. The expression of mechanical stress related genes in subchondral bone of rat osteoarthritis model was explored according to the existing literatures, and then the results were identified through quantitative real-time PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: Three important mechanical stress related differentially expressed genes included: Postn, Ihh and Bmp5, and were confirmed by quantitative real-time PCR. In the experimental group, Postn was significantly expressed at 1 week after operation, and the difference between two groups was significant (P < 0.05), and 2 weeks after operation, Postn was still highly expressed, but there was no significant difference between two groups (P > 0.05). Bmp5 was significantly expressed at 1 week after operation, but the difference between two groups was significant (P < 0.05), and at 2 weeks after operation, Bmp5 was highly expressed, but there was no significant difference between two groups (P > 0.05). Ihh was highly expressed at 1 and 2 weeks after operation, and the difference between two groups was significant (P < 0.05). Mechanical stress is the key stress in osteoarthritis. Further research of mechanical stress related genes and their pathway might provide more evidence for pathogenesis of osteoarthritis, thus discovering the targets for early diagnosis and early treatment.

Key words: bone and joint implants, bone and joint biomechanics, osteoarthritis, subchondral bone, mechanical stress, Postn, Bmp5, Ihh, rat osteoarthritis model, joint instability, gene chip;, whole genome;, 863 program

中图分类号:

R318

方航，张荣凯，陈郁鲜，宋炎成，蔡道章. 机械应力相关基因在骨关节炎软骨下骨的表达[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(22): 4084-4090.

Fang Hang, Zhang Rong-kai, Chen Yu-xian, Song Yan-cheng, Cai Dao-zhang. Expression of mechanical stress related genes in subchondral bone of rat osteoarthritis model[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(22): 4084-4090.

图/表（结果） 3

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引言

骨性关节炎是一种退变性关节疾病，表现为关节软骨退变，并累及关节的其他组织，包括滑膜、软骨下骨及肌肉、韧带等。世界卫生组织在1999年将骨性关节炎定义为：骨性关节炎是由于机械和生物性因素共同作用所导致的关节软骨细胞、细胞外基质、软骨下骨合成和降解动态失衡所致的全关节疾病。由此可见，机械应力因素及生物性因素在骨性关节炎发生发展中起着重要的作用，其他各种原因最终也都是通过影响这两个关键性因素而起作用的。

Blagojevic等^[1]在一个综合了36篇文献的Meta分析中发现所有的研究都显示肥胖及超重是膝关节骨性关节炎的危险因素。肥胖所导致的关节软骨及软骨下骨负重增加，与各种原因导致的关节受力异常(如韧带断裂、半月板损伤等)，被认为是骨性关节炎发病的重要因素^[2] 。刘兴漠等^[3]通过观察周期性张应力对兔骨性关节炎软骨细胞中p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)表达及其磷酸化的影响，发现力学载荷可影响p38 MAPK的表达及磷酸化程度，提示机械应力在骨性关节炎发生发展中起着重要作用。

此外，骨性关节炎通常被认为是一种软骨的疾病，然而越来越多的证据显示骨性关节炎更是一种骨组织的疾病^[4-7] 。软骨下骨的改变甚至可能比软骨的降解更早发生，且随着骨性关节炎的进展而加剧。软骨下骨是人体关节一种有效的机械应力吸收装置，同时，其营养或者细胞因子可通过潮线处的裂缝或通道被转运到覆盖其上的软骨，影响软骨细胞的代谢^[8] 。然而在体内，软骨下骨的改变在骨性关节炎中是否先于软骨仍有待进一步的研究。

因此，深入了解骨性关节炎早期软骨下骨机械应力相关基因的表达情况，有助于揭示机械应力在骨性关节炎发生发展中的作用，从而更深入了解骨性关节炎的发病机制，为寻找骨性关节炎早期诊断及早期治疗奠定基础。

材料方法

设计：随机对照动物实验。
时间及地点：实验于2010年7月至2011年12月在中山大学北校区实验动物中心及中山大学附属第三医院中心实验室完成。
材料：
骨关节炎软骨下骨中机械应力相关基因的表达实验所用仪器与试剂：
Main reagents and instruments:

实验动物：从中山大学实验动物中心挑选鼠龄、体质量及大小相近(10周龄，体质量300-325 g)的雄性SD大鼠60只，并饲养于该中心SPF级屏蔽环境中。动物分笼饲养，自由饮水及进食。房间温度：(23±3)℃，相对湿度：(60±5)%，照明时间：12 h/d。
方法：
SD大鼠骨性关节炎模型的建立及软骨下骨RNA的提取：将动物编号，并按照随机法将其分为实验组(n=30)和对照组(n=30)。SD大鼠的骨性关节炎造模方法及软骨下骨RNA的提取同之前的报道[9]。实验组大鼠用10%水合氯醛(4 mL/kg)腹腔内注射麻醉后，选取右膝关节，去毛后，常规消毒铺巾，依次切开皮肤、膝关节囊，行内侧副韧带切断+内侧半月板切除，用5-0可洗手线独立缝合关节囊，以5-0丝线间断缝合伤口。术后肌注1次青霉素4×104 U抗感染，待麻醉苏醒后腹腔注射曲马多(10 mg/kg)止痛。同样的方法处理对照组大鼠，但不切断内侧副韧带，也不切除内侧半月板。实验组及对照组各分为3个观察时间点：1，2，4周。每个时间点实验组及对照组大鼠各10只，提取软骨下骨RNA后，其中5只用于基因芯片分析，另外5只用于qRT-PCR验证，以保证两部分实验结果的独立性。
软骨下骨RNA的纯化、鉴定及标记：
软骨下骨RNA的纯化：使用RNAeasy Mini Kit对所提取的RNA进行纯化，软骨下骨总RNA≤85 μL，加入Reaction buffer 10 μL、Baseline-ZERO Dnase 5 μL，加RNase-free水，混合成100 μL工作液；37 ℃水浴30 min；加入350 μL Buffer RLT，摇匀；加入250 μL无水乙醇，充分混合；转入RNeasy mini柱子内，≥ 8 000×g离心15 s，弃去滤过液；吸取500 μL Buffer RPE到RNeasy mini柱子内，≥8 000×g离心洗涤15 s，弃去滤过液，2次；转入2 mL的收集管，全速离心1 min；转入1.5 mL收集管中，吸取40 μL RNase free水，≥ 8 000×g离心洗脱1 min。
软骨下骨RNA的鉴定与标记：①将纯化后的RNA 2 μL 在体积分数为0.6%的甲醛变性琼脂糖凝胶上进行电泳(电压：180 V，30 min)，主要观察RNA的28S、18S及5S三个条带是否清晰，判断RNA的完整性及有无DNA污染。②用紫外分光光度计测量RNA吸光度值及浓度，比值表示RNA的纯度，该比值位于1.8-2.0之间，说明RNA纯度高，比值低于1.8，表明RNA存在污染。以生物素Cy-3标记纯化的RNA。
杂交、基因芯片的洗脱及扫描：采用安捷伦大鼠全基因表达谱芯片(每个芯片含41 000个基因探针)，每个标记的RNA标本分别对应一个基因芯片进行杂交。先将足量的基因芯片洗脱液预热至37 ℃，然后按洗涤工作站说明，进行芯片洗脱。调整好安捷伦基因芯片扫描仪的参数进行芯片扫描。
基因芯片数据的预处理与归一化校正处理：扫描结果使用数据处理软件Agilent Feature Extraction Software (version 10.5.1.1)，按照样点的大小和规则度、信噪比、样点周围的背景强度、样点背景的均一程度、信号的饱和程度等决定芯片数据质量的因素进行预处理，将一些质量很低，数据可能不准确的点予以滤出，并对芯片信号强度和各芯片均一性进行评价。芯片数据预处理及芯片数据校正使用Agilent GeneSpring GX software (version11.0)软件系统，并对芯片数据进行归一化校正处理。根据基因差异表达的倍数、t检验及P值来确定差异表达基因，其中，只有差异表达倍数>2倍，P < 0.05认为差异有显著性意义。
实时荧光定量PCR：采用染料法(SYBR Green I)对进行“基因芯片数据的预处理与归一化校正处理”中发现的与机械应力相关的差异表达基因水平进行相对定量分析，按照ΔΔCt解析法来进行实验设计，以GAPDH作为内参照基因。各基因引物序列如表1所示。标本RNA反转录、qPCR反应体系建立实验步骤按试剂盒说明操作。PCR反应条件，采用了标准的三步法程序进行反应：95 ℃预变10 min 1个循环；95 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s 40个循环。

主要观察指标：基因表达的改变及其方向、程度。
统计学分析：采用SPSS 19.0统计软件，通过t 检验分别对各基因的qRT-PCR实验结果进行统计学分析，α=0.05。

讨论

机械应力相关基因在本骨性关节炎模型中造模后第1周均出现明显的高表达。而在之前的研究中发现，造模后1周组织学染色分析显示关节软骨尚没有出现明显的病理表现^[10] 。一些与机械应力相关的基因(Postn、Ihh及Bmp5等)在骨性关节炎发病中可能起着重要的作用。其中，Postn是首先在小鼠成骨细胞中发现的一个蛋白质，高度保守，可由转化生长因子β诱导，具有促黏附和移行的功能^[11-12] ；机械应力的刺激亦可引起Postn表达水平的变化^[13] 。Postn不仅存在于成骨细胞中，还存在于许多肿瘤细胞、成纤维细胞、血管平滑肌细胞、损伤部位的血管，参与肿瘤的血管新生、转移以及细胞移行的过程^[14-17] 。在乳腺癌的转移中，浸润性的肿瘤干细胞通过诱导肺组织基底膜Postn的表达，通过聚集Wnt配体，激活Wnt通路，从而发生乳腺癌的肺转移^[18] 。另有研究发现Postn在病变的心瓣膜细胞中诱导血管新生和基质金属蛋白酶的产生，从而参与瓣膜性心脏病的发病过程^[19] 。有趣的是，Wnt通路及基质金属蛋白酶也参于骨性关节炎的发生发展，并在这中间起着非常重要的作用^[20-26] 。Wnt通路信号传导非常复杂，且其下游效应因Wnt配体、受体、拮抗物以及最终控制靶基因表达的β-catenin/转录因子复合物特殊结合的不同而不同。其中，惟一一个在骨性关节炎骨中被发现表达上调的Wnt配体——Wnt5B，在成骨细胞分化过程中也存在表达上调的情况^[27] 。已有研究证实Wnt5B编码的蛋白质对骨及软骨细胞都同时具有激活和抑制的效应，根据其所结合的不同细胞表面受体，其信号通过经典或非经典的Wnt通路传导^[27-29] 。除了Wnt5B之外，还有其他重要的Wnt通路相关基因被发现在骨性关节炎骨中差异表达。其中，与对照组相比，编码Wnt5B辅受体Fzd3的基因以及细胞外的Wnt拮抗物Sfrp5呈表达下调的改变，这个结果也提示Wnt信号传导在骨性关节炎中增强，而持续激活的经典Wnt/β-catenin通路可引起基质的降解^[30] 。在体外培养的软骨细胞培养基中加入Wnt3A或者诱导β-catenin的持续表达可刺激Mmp3，Mmp13，ADAMTS-4和ADAMTS-5的表达，并引起蛋白聚糖的丢失^[31-32] 。Thomas等^[33] 在一个研究中于培养的软骨细胞加入Wnt3A预激活后，给细胞加以一定的应力。结果显示机械应力联同Wnt，可抑制软骨细胞基质基因的转录，同时增强分解代谢因子的表达，破坏软骨的内稳态。

Wnt及基质金属蛋白酶在骨性关节炎发生发展中的作用从侧面进一步说明了Postn在骨性关节炎发病中的重要性。然而，其表达水平与骨性关节炎发生发展的关系未有报道，有必要对该蛋白与机械应力两个因素在骨性关节炎发生发展中的作用进一步深入研究。

Ihh是一个在机械应力信号的转导、软骨细胞增殖的激活过程中起关键作用的传导因子^[34] 。重复的机械应力可刺激Ihh的表达，进而反过来激活间充质细胞的增殖以及软骨的合成^[35] 。在骨性关节炎患者中，Hh信号呈激活状态，且其在软骨细胞中的信号水平的强度与骨性关节炎的严重程度呈正相关。有研究通过阻断Hh信号通路，发现大鼠骨性关节炎模型中关节软骨退变延缓^[36] ，提示该蛋白是一个有潜力的治疗靶点，而其在软骨下骨中的表达变化及其与骨性关节炎发病的关系未有进一步深入的报道。

Bmp5也在骨骼发育过程中起着重要作用。在大鼠胫骨骺板中，Bmp5的表达引起软骨细胞增殖及软骨基质合成的增加。同时，Bmp信号与骨组织机械应力传导密切相关^[37] 。实验发现，早在术后1周，软骨组织未有明显组织病理学改变的情况下，Bmp5即已经明显高表达，其与机械应力在骨性关节炎中的发病作用及骨赘的形成可能密切相关，对其在软骨下骨中的作用值得进一步的研究。

总之，机械应力因素在骨性关节炎发生发展中起着重要的作用，对软骨下骨早期由机械应力诱导高表达的基因进一步的深入研究，有望发现新的早期干预靶点，从根本上延缓或阻断骨性关节炎病程的进展。

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